Агароза с низкой температурой плавления

Низкоплавкая агароза (LMPA) использует модификации агарозы для ослабления сетчатой структуры, чтобы облегчить расплавление геля вокруг ДНК и освободить ДНК, а также очистить её — без расплавления геля! Полный текст с дополнительной информацией об агарозе: http://bit.ly/agaroses Когда я провожу электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК по размеру, я обычно просто хочу проверить, сработала ли моя полимеразная цепная реакция (ПЦР) (скопировала ли она нужный мне короткий участок ДНК). Я загружаю лишь крошечный образец продукта ПЦР — ровно столько, чтобы определить, сработала ли она (хотя это может показать только, соответствует ли размер продукта ожидаемому, а не правильность его последовательности, поэтому, если я хочу проверить последовательность, мне нужно отправить образец на секвенирование). Я не хочу загружать больше, чем нужно, так как это будет просто «тратой», поскольку, как только я увижу, сработала ли она, я просто выбрасываю гель. НО иногда вам нужно сохранить то, что находится в геле. На самом деле, вы можете использовать препаративный электрофорез в агарозном геле в качестве этапа очистки при очистке ДНК. ПЦР работает с использованием коротких фрагментов ДНК, называемых праймерами, которые вы разрабатываете, чтобы расположить их по обе стороны от начала и конца участка двухцепочечной ДНК (дцДНК), который вы хотите скопировать (ампликон). Вы нагреваете его, чтобы разделить нити ДНК (плавление) ⏩ позволяете праймерам присоединиться (по одному на нить) (отжиг) ⏩ затем позволяете ДНК-полимеразе (ДНК-полимеразе) копировать матрицу, как поезд, прокладывающий рельсы перед собой ⏩ повторяйте это много раз 🔁, чтобы получить много копий. Подробнее здесь: http://bit.ly/pcrtrain При проведении ПЦР вы часто получаете «неспецифические продукты», потому что праймеры могут неправильно связываться (связываться не в том месте). Если это произойдёт, то при разделении продуктов по размеру путём пропускания их через агарозный гель (поры которого замедляют движение более крупных частиц) вы получите полосы разных размеров, из которых только одна будет нужной (надеюсь, самая большая и яркая!). Часто этого достаточно для достижения желаемого результата, НО если вам нужна сверхчистота, необходимо отделить желаемый ампликон от других продуктов. Для этого можно провести препаративный электрофорез, при котором вы пропускаете весь продукт ПЦР, а не только небольшой фрагмент для сравнения. Затем вы физически вырезаете нужную полосу и используете метод, называемый экстракцией из геля, чтобы освободить ДНК из гелевой оболочки. Это также можно сделать, если вы хотите отделить продукты после расщепления рестрикционными ферментами перед лигированием фрагментов: http://bit.ly/molecularcloningguide ; YouTube: https://www.youtube.com/watch?v=U0O2T7NBUgg Но чтобы извлечь ДНК из геля, вам нужно «де-гелевый» гель — его нужно расплавить. НО вы не хотите расплавлять (денатурировать) ДНК. В ПЦР мы хотели денатурировать ДНК (расщепить нити), чтобы мы могли её скопировать. Но только на первом этапе (каждого цикла). Фактически, в конце ПЦР мы охлаждаем всё, чтобы убедиться, что нити могут снова соединиться, и наши конечные продукты будут двухцепочечными. Когда вы настраиваете программу ПЦР на вашем термоциклере (аппарате, который держит пробирки и контролирует температуру), вы указываете ему выполнить определённое количество циклов (обычно 20-30) расплавления, отжига (немного снизить температуру, чтобы позволить праймерам связаться), удлинения (позволить копированию продолжаться). А затем, после завершения всех этих циклов, его нужно охладить и поддерживать низкую температуру. Это позволяет нитям снова соединиться. Именно с этими вновь соединенными нитями вы имеете дело при проведении электрофореза в агарозном геле. И когда вы извлекаете ДНК из геля, вам нужно, чтобы она оставалась двухцепочечной. Это означает, что вы не можете нагреть ее так сильно, как при ПЦР, для этапов плавления. Чтобы расплавить агарозу с нормальной температурой плавления (NMPA), вам пришлось бы нагреть ее примерно до 93°C, что означало бы прощание со второй нитью ДНК. Но прежде чем вы начнете плакать, есть супергерой, который ждет, чтобы спасти положение — агароза с низкой температурой плавления (LMPA). Как следует из названия, он имеет более низкую температуру плавления (~65°C), поэтому вы можете расплавить гель вокруг ДНК (превратить агарозный гель в жидкий раствор) без расплавления самой ДНК (разделения нитей ДНК), поэтому ваша двухцепочечная ДНК остается двухцепочечной. Эта сверхспособность обусловлена наличием у LMPA химических «ботинок» на некоторых «ножках», благодаря которым они не могут так сильно взаимодействовать. Эти «ботинки» часто представляют собой гидроксиэтильные группы (которые содержат -OCH₂CH₂-OH вместо просто «-OH») или метоксильные группы (-O-CH₃). Эти модификации добавляют атомы углерода, которые лучше противостоят притяжению кислорода, поэтому атом кислорода становится менее ➖, и его притяжение слабее (а при